بافرهای محلول سازی
بافرهای محلول سازی ممکن است به تنهایی یا در ترکیب با روشهای دیگر متلاشی سازی سلولی به کار گرفته شوند . برای انجام جداسازی مناسب در بعد اول ، نمونه های پروتئینی باید کاملا غیر توده ای و به صورت محلول باشند . این امر برای تمامی انواع نمونه ها در هر مرحله ای از آماده سازی ضروری است . برای این منظور معمولا ، در ترکیب بافرهای محلول سازی از یک یا دو معرف کائوتروپیک ، دترجنت ، معرف احیا کننده ، و آمفولیت استفاده می شود .
در این قسمت به معرفی این اجزاء و نقش آنها در محلول ساختن و آماده سازی نمونه برای انجام الکتروفورز 2 بعدی می پردازیم .
معرفهای کائوتروپیک
بسیاری از پروتئین ها در اشکال طبیعی (Native) دارای چندین شکل فضایی مختلف هستند و به همین دلیل ممکن است در الکتروفورز 2 بعدی الگوهای پیچیده ای ایجاد کنند . این وضعیت تفسیر نمایه های 2 بعدی را دچار مشکل خواهد کرد . برای ساده تر کردن نمایه دو بعدی و حذف اثر شکل فضایی در ایجاد نقاط متعدد مربوط به یک پروتئین و ایجاد پیکی منفرد از آن ، بر هم زدن شکل طبیعی (Denaturing) توسط معرف ها کائوتروپیک انجام می شود .
اوره بهترین عامل کائوتروپیک در آماده سازی نمونه برای الکتروفورز دو بعدی است ، که معمولا با غلظت 8 مولار استفاده می شود . اوره از 2 طریق مستقیم و غیر مستقیم باعث بر هم زدن شکل طبیعی و باز شدن تا خوردگی (Unfolding) مولکولهای پروتئینی می شود . مولکولهای اوره مستقیما جذب گروههای آبدوست (Hydrophill) و قطبی در سطح پروتئین ها می شوند . این مولکولهای جذب شده به گروههای قطبی ، اثر دفعی بر یکدیگر دارند . برا اثر این نیروهای دفعی بر سطح ، مولکول پروتئین باز شده و متورم می گردد . همین امر گروههای آبگریز در سطوح داخلی پروتئین را در معرض محیط خارجی قرار می دهد . ورود آب و اوره به محیط داخلی پروتئین سبب ایجاد بی ثباتی و بر هم زدن شکل طبیعی پروتئین می شود .
از طرف دیگر اوره از طریقی غیر مستقیم و با تغییر در ساختار و دینامیک آب می تواند در بر هم زدن شکل طبیعی پروتئین مؤثر باشد . حضور این ماده باعث اختلال در شبکه پیوند هیدروژنی بین مولکولهای آب شده و ایجاد فضایی خالی در بین مولکولهای آب می نماید . این کاهش نا مطلوب در آنتروپی با فشار مولکولهای آب به مولکولهای آبگریز جبران می شود ، تا کمترین فضای ممکن را ایجاد نمایند . این پدیده به اثر آبگریزی (Hydrophobic Effect) موسوم است . اوره در غلظتهای بالا (6 الی 8 مولار ) ، نیروهای مؤثر در متراکم کردن ساختمان پروتئین ها به خصوص اثر آبگریزی را کاهش می دهد . به این ترتیب به طور غیر مستقیم ، قسمتهای مرکزی آب گریز در معرض و در دسترس عوامل محیطی قرار می گیرد .
زمانی که به شرایط کائوتروپیکی قوی نیاز باشد ، ترکیبی از تیواوره 2 مولار و اوره 5 الی 8 مولار مورد استفاده قرار می گیرد . تیواوره در مقایسه با اوره دناتوره کننده قوی تری است . اما نمی توان آن را به تنهایی مورد استفاده قرار داد ، چرا که حلالیت بسیار کمی در آب دارد . این ماده در محلول غلیظ اوره حلالیت بیشتری دارد . به همین دلیل مخلوط های اوره – تیواوره قدرت محلول کنندگی بهتری را از خود نشان می دهند . به علاوه این ترکیب قادر به جلوگیری از فعالیت آنزیمهای پروتئولیتیک نیز هست که در حضور اوره به تنهایی هم ممکن است فعال باقی بمانند .
درجه خلوص اوره بسیار مهم است و باید از حرارت دادن آن ، به دلیل تشکیل ایزوسیانات که از تجزیه اوره حاصل می شود ، خودداری کرد . ایزو سیانات باعث کربامیلاسیون پروتئین ها و تشکیل نقاط غیر واقعی در الگوی نهایی الکتروفورز 2 بعدی می شود . محلول حاوی اوره پایدار نیست و از ذوب و انجماد مکرر محلول حاوی اوره باید خودداری کرد . از طرفی دیگر ، اگر چه استفاده از تیواوره در نمونه باعث افزایش در بروز نقاط پروتئینی می شود ، اما ایجاد رگه های (Streaking) عمودی و نقاط مبهم و نامشخص در ناحیه اسیدی ژل را نیز سبب می شود که هنوز راه حل مناسبی جهت حذف این زواید پیدا نشده است .
مرجع : استفاده شده از manual دستگاه IEF
نظرات شما عزیزان:
|
روز بخير كاربر مهمان! 
